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类胡萝卜素是一组红、橙、黄色素，它们作为维生素A前体和抗氧化剂。动物只能通过饮食获得类胡萝卜素。在自然界发现的类胡萝卜素中，三分之一以上是海洋来源，但目前对海洋类胡萝卜素吸收的研究有限。双壳类动物有内收肌，在扇贝中通常是白色的。然而，“海大金贝”新品种可以通过其橙色闭壳肌来区分，橙色闭壳肌是由类胡萝卜素的积累引起的。研究贝类胡萝卜素积累的相关基因，有助于我们了解海洋生物类胡萝卜素吸收的机制今天分享给大家一篇发表在Gene上的文章。

研究背景

类胡萝卜素是由植物、藻类、细菌和真菌合成的一类不同的红色、橙色和黄色色素。动物和人类通常只能通过饮食获得类胡萝卜素，类胡萝卜素长期以来被认为是必需的营养素。一些类胡萝卜素起着强大的抗氧化剂的作用，它提供了对单线态氧和自由基的保护，维生素原A类胡萝卜素可以转化为维生素A，这是视网膜在低光和彩色视觉中所需要的。类胡萝卜素在免疫增强、繁殖和生长等生物过程中发挥作用。

类胡萝卜素对动物和人类健康的重要益处使得类胡萝卜素的吸收机制非常吸引人。迄今为止在自然界中发现的所有类胡萝卜素中，超过三分之一来自海洋生物。然而，对海洋生物类胡萝卜素的吸收和代谢的研究还很有限。在双壳类动物中，闭壳肌通常是白色的，但有研究对扇贝闭壳肌中的类胡萝卜素（果胶酮和果胶黄素）进行了研究报道。随后，一个富含类胡萝卜素的新品种“海大金贝”被研制出来，为研究双壳类胡萝卜素的吸收和贮藏机制提供了一个有利模型。

类胡萝卜素是脂溶性分子，脂质与类胡萝卜素在人体内的吸收有密切关系。最近的研究表明，与饱和脂肪酸（SFAs）相比，单不饱和脂肪酸（MUFAs）有促进类胡萝卜素吸收的趋势，参与调节脂肪酸代谢的基因与类胡萝卜素的生物利用度有关。

硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD）是合成多不饱和脂肪酸的限速酶已成为脂质代谢的关键调节因子。在动物组织中，MUFAs是由饱和的脂肪酸前体通过一个需氧过程，使用三组分酶系统，涉及黄素蛋白NADH依赖性细胞色素b5还原酶、细胞色素b5和SCD。SCD作为催化MUFAs合成的中心产脂酶，在脂肪酰CoA底物的Δ9位催化了顺双键的形成。它的首选去饱和底物为棕榈酰CoA和硬脂酰CoA，分别转化为棕榈酰CoA（16:1）和油酰CoA（18:1）迄今为止，共有5个SCD基因（SCD1-5）在哺乳动物中被鉴定，但SCD2-4只在啮齿动物中被发现。

在脊椎动物中，有许多SCDs已经被鉴定出来，但未见关于无脊椎动物SCD基因的报道，也没有关于这个基因可以在公共数据库中找到。在之前的一项研究（未发表的数据）中，我们比较了海大金贝和白虾夷扇贝，鉴定了一个差异表达的SCD基因（PySCD）。在本研究中，我们获得了该基因的全长cDNA和基因组DNA序列，并对其进行了分析基因组组织、蛋白质结构和时空表达。我们还比较了PySCD在白虾夷扇贝和海达金扇贝在不同组织和不同发育阶段的表达水平。除了鉴定海洋无脊椎动物的SCD基因外，我们的结果还表明SCD参与了扇贝类胡萝卜素的生物利用度。

材料和方法

2.1

样品收集

样品收集、RNA提取及cDNA合成、PySCD基因克隆

本研究所用扇贝均取自獐子岛渔业集团有限公司。分别建立了白闭壳肌虾夷扇贝和橙色闭壳肌海大金贝两个群体，通过对多个性成熟扇贝进行人工受精。胚胎和幼虫，包括新受精卵、囊胚、原肠胚，收集D型幼虫和维利格幼虫，暂时贮存在RNAwait，然后保存在-80°C。在每个发育阶段采集三个平行样本，每个样本至少使用个胚胎或幼虫个体。从两个群体中随机挑选成年（一龄）扇贝，然后运到实验室在盐度为25‰-30‰、温度为8℃的充气海水中饲养，并喂饲金褐藻每天一次。七天后，分别从“海大金贝”和虾夷扇贝种群随机采集12个个体，其外套膜、鳃、性腺、肾、闭壳肌和消化腺，立即冷冻在液氮中，然后储存在-80°C下，其他成扇贝也储存在-80°C下。使用试剂盒进行RNA提取反转录及基因克隆，所用引物见下表1。然后对获得的基因序列进行比对分析。采用qRT-PCR技术，分析了PySCD在胚胎、幼虫和成体组织中的表达水平。最后进行数据分析。

结果及讨论

3.1

PySCD基因序列特征分析

利用RACE获得了扇贝PySCD基因bp的全长cDNA序列（图1A）。该序列包含一个bp的开放阅读框，编码个氨基酸。预测在终止密码子下游–bp处发现信号（AATAA）。对虾夷扇贝基因组数据库（未公布的数据）的搜索发现了一个跨越整个PySCDcDNA序列的单一序列。在虾夷扇贝的转录组和基因组数据中没有发现其他SCD同源物。同样，在太平洋牡蛎（crassostreagigas）基因组数据集（AFTI.1）中，只发现了一个SCD基因，表明双壳类基因组中可能只有一个SCD基因。PySCD基因的基因组和cDNA序列已存入GenBank数据库编号分别为KC和KC。

cDNA和基因组DNA序列比对表明，PySCD基因包含4个、、和bp的外显子和3个、和bp的内含子。所有的内含子-外显子边界都符合GT-AG规则。对其它物种SCD基因外显子/内含子结构的进一步分析表明，所鉴定的SCD5基因序列均具有5exon/4intron结构。相比之下，SCD1基因在具有5exon/4intron结构的硬骨鱼类中表现出6exon/5intron结构。与SCD1相似，啮齿动物SCD2-4基因也由6个外显子和5个内含子组成。尽管显示出不同数量的外显子和内含子，PySCD及其脊椎动物同源物在其核苷酸序列和蛋白质中共享保守的外显子边界（图。1B、2A）。另外，两个SCD外显子的长度在物种间是保守的（图1B）。通常，保守的外显子编码与基因最基本功能相对应的氨基酸序列。在SCDs中，8种组织肽中有5种对其去饱和酶功能具有催化作用，它们位于由两个保守外显子编码的区域（图2A），这意味着PySCD和脊椎动物SCDs的功能可能是保守的

在PySCD的5′端侧翼区域，发现了几个假定的转录因子结合位点（图3A，B）。除了普遍存在的转录因子的结合位点，如TATA结合蛋白、八聚体结合蛋白、活化蛋白1和cAMP反应元件外，对SCD转录至关重要的转录因子的结合位点，包括SREBP（甾醇调节的元件结合蛋白），CCAAT增强剂（核因子Y）和RXR（维甲酸X受体）-RAR（维甲酸受体）异二聚体也存在于该区域（图2A）。SREBP、CCAAT增强子和RXR-RAR异二聚体在PySCD启动子区的结合位点的存在表明PySCD的转录调控机制相似脊椎动物的SCD基因。

在PySCD5′端侧翼区域发现一个37bp的小卫星序列（图3C）。重复次数和重复单位序列在个体间都是多态的，这意味着基因表达调控位点。琼脂糖凝胶电泳在该位点检测到两个等位基因（A和B）（图S1）。在被测扇贝中共发现三种基因型（AA、BB和AB）。基因型（p=0.）和等位基因（p=0.）无显著差异海达金扇贝和白扇贝在这个位点上的出现频率（表S1）表明，这一区域可能与这两种扇贝之间PySCD调节的差异无关。

3.2

比对和系统发育分析

Blast分析表明，PySCD的翻译氨基酸序列（aa）与其它scd最为相似，具有脊椎动物同源性的特征。PySCD蛋白序列与太平洋牡蛎SCD蛋白序列、斑马鱼、爪蟾、小鼠和人类的SCD1序列，人类的SCD5序列分别显示了75%、72%、71%、63%、64%和70%的同源性（图3A）。PySCD的组氨酸盒基序（HMs）与太平洋牡蛎、斑马鱼、爪蟾、老鼠和人类的同源性分别为87.5%、%、%、93.75%和93.75%。

与其他scd相似，PySCD具有膜锚定脱饱和酶的所有特征。四个跨膜结构域（TMs）位于氨基酸45–67、72–93、–和–处（图2A）。在PySCD中发现了三个保守的HMs（HXXXXH、HXXHH和HXXHH），共含有八种组氨酸。在哺乳动物、真菌、蓝藻、昆虫和植物等多种生物中，HMs被认为是膜锚定脱饱和酶高度保守的区域。大鼠δ9去饱和酶的定点突变研究表明八个保守的组氨酸残基对其去饱和酶功能具有催化作用，它们可能参与了催化位点的形成。

利用I-TASSER构建了PySCD的三维同源模型。结果表明，所有的TM结构域都是螺旋状的，所有的HMs都在同一侧，与螺旋状结构并列（图3B）。基于这个模型，我们预测了PySCD更直观的膜拓扑结构，其中N-和C-末端和保守的组氨酸残基朝向内质网（ER）的细胞质侧，四个TMs被内质网内腔中的两个非常短的环隔开（图2C）。该模型与小鼠SCD的膜拓扑结构相似。PySCD与脊椎动物同源物之间的3D结构和氨基酸序列的保守性表明，SCD在扇贝和高等生物中的功能相似

为了研究PySCD与其他SCD家族成员之间的关系，通过对比来自不同家族的SCD蛋白中的保守外显子，生成了进化树（图4）。两个不同的树上有许多类群：脊椎动物SCDs，包括scd1和scd5，聚在一起；无脊椎动物SCDs聚在一起。先前的研究表明基因组复制（1R），其中一个复制的SCD基因丢失，剩余的基因在第二次基因组复制（2R）后产生SCD1和SCD5。SCD5已经从硬骨鱼类和一些啮齿动物中丢失，在没有SCD5的物种中，它已经被同源生物所取代，如小鼠中的SCD2-4和斑马鱼中的SCD1b。扇贝中发现的单个SCD基因可能代表在基因组复制之前脊椎动物中存在的共同祖先来源。

3.3

海大金贝和虾夷扇贝中

PySCD的时空表达分析

应用qRT-PCR技术，分析了虾夷扇贝胚胎、幼虫和成体组织中PySCD的表达。PySCD转录本在所有分析的发育阶段取样，包括“海大金贝”和白色虾夷扇贝中的受精卵、囊胚、原肠胚、D形幼虫和面盘幼虫（图5A）。这两种扇贝的面盘幼虫表达量最高，说明在扇贝发育的这一阶段需要更多的MUFAs。在刚刚受精的卵中检测到PySCDmRNA，表明该转录本可能是母系来源。在两种扇贝（图5C）的所有分析成年组织（外套膜、鳃、性腺、肾脏、闭壳肌和消化腺）中也检测到PySCDmRNA，在消化腺、性腺和闭壳肌中有较高的表达水平。在脊椎动物中，SCD也在不同的组织中转录。例如，人SCD1基因主要在肝、肺、脂肪组织和脑中表达，SCD5基因在脑、肾、肺和胰腺中高度表达。SCDs的普遍表达，包括PySCD，表明SCDs可能在多种细胞类型中发挥作用。

尽管这两种扇贝的PySCD表达模式相似，但PySCD表达水平存在显著差异（图5B，D）。在成熟个体中，海大金贝和虾夷扇贝的PySCD比较在闭壳肌和消化腺中的表达水平极显著增高（p=0.）和（p=0.）。海大金贝的性腺中也检测到明显多于虾夷扇贝的PySCD-mRNAs（p=0.）。我们之前的研究在海大金贝的闭壳肌中检测到类胡萝卜素，它们呈亮橙色，但白色虾夷扇贝的闭壳肌中没有类胡萝卜素。由于闭壳肌类胡萝卜素含量的显著差异，使得这两种扇贝很容易用眼睛根据收肌的颜色来区分。在消化腺和性腺中，海大金贝的类胡萝卜素含量也比白色的虾夷扇贝高。SCD是SFAs生物合成MUFAs的限速酶，MUFAs促进类胡萝卜素的吸收。海大金贝组织中PySCD的转录增加，积累的类胡萝卜素比白色扇贝多，提示PySCD可能通过调节MUFA的产生参与扇贝类胡萝卜素的吸收。进一步研究PySCD的表达、MUFA的生物合成和类胡萝卜素积累之间的关系，有助于进一步了解扇贝PySCD的功能和类胡萝卜素的吸收。此外，RXR-RAR异二聚体结合位点也存在于PySCD5′端的侧翼区域。据报道，RAR是维甲酸（RA）的受体，维甲酸是一种从类胡萝卜素中提取的维生素a代谢物。在哺乳动物中，RA通过RAR和RXR调控SCD的表达。RXR-RAR杂二聚体结合位点在PySCD中的存在表明，海大金贝中较高的类胡萝卜素浓度可能会增加RA的产生，进而通过RAR和RXR产生更多的PySCD转录物。海大金贝中RA的产生是否增加，RA是否像哺乳动物一样调节PySCD的转录，还有待进一步阐明。

我们还比较了海大金贝和白虾夷扇贝胚胎和幼虫中PySCD的表达水平。然与白色扇贝相比，海大金贝的维面盘幼虫表达的PySCD-mRNAs显著增加（p=0.5），表明这一阶段两种扇贝的MUFA合成可能存在差异。进一步分析这两种扇贝胚胎和幼虫发育过程中类胡萝卜素的积累，可以为进一步研究海大金贝类胡萝卜素的积累与PySCD调控类胡萝卜素之间的关系提供有用的信息。

结论

总之，我们从扇贝中获得了软体动物SCD基因PySCD的全长cDNA和基因组DNA序列，并比较了其在富含胡萝卜素和白色虾夷扇贝中的时空表达水平。该基因在成体组织及扇贝胚胎和幼虫发育过程中普遍表达。在富含类胡萝卜素的扇贝组织和幼虫中，PySCD基因的表达明显高于白色扇贝。这项研究代表了来自软体动物的SCD基因的第一个特征。我们的数据表明，PySCD在多种生物过程中发挥作用，可能与扇贝类胡萝卜素的积累有关

-END-

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